腦片膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法

腦片膜片鉗選擇海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究中應(yīng)用較為廣泛標(biāo)本之一。其原因有以下幾點(diǎn)：1、海馬與腦的其它部位相對(duì)隔離，較易剝離，且剝離后受到的損傷較小；2、海馬具有高度分化的片層結(jié)構(gòu)，一方面，海馬神經(jīng)環(huán)路在片層中的分布有一定的空間規(guī)律，如錐體細(xì)胞胞體分布在錐體細(xì)胞層，而雪氏側(cè)支突觸分布于輻射層，且海馬中存在一個(gè)三突觸聯(lián)系的回路，即穿通纖維-齒狀回顆粒細(xì)胞層、苔狀纖維-CA3區(qū)錐體細(xì)胞層、雪氏側(cè)支-CA1區(qū)錐體細(xì)胞層等，因此，在海馬中可以較準(zhǔn)確地記錄到特定神經(jīng)元或突觸的反應(yīng)；另一方面，這種板層結(jié)構(gòu)有利于解釋在某一部位記錄到的細(xì)胞外場(chǎng)電位的意義。這些都使海馬成為腦片膜片鉗電生理學(xué)研究的理想標(biāo)本。本文對(duì)海馬腦片膜片鉗的操作規(guī)程及注意事項(xiàng)總結(jié)如下。

一、海馬腦片膜片鉗的制備

       腦片制備中，海馬分離應(yīng)在斷頭后10分鐘內(nèi)完成，5~6分鐘為宜。在分離海馬時(shí)，還應(yīng)注意不要扭轉(zhuǎn)或撕扯海馬，更不要損傷海馬。分離海馬的速度和質(zhì)量是保證海馬腦片制備成功的關(guān)鍵所在。

       評(píng)價(jià)腦片活性簡(jiǎn)單的方法是記錄腦片上的群峰。在一個(gè)狀態(tài)良好的腦片上記錄到的群峰在一個(gè)很寬的刺激強(qiáng)度范圍內(nèi)始終是單峰的。出現(xiàn)多個(gè)群峰往往提示抑制性突觸功能已受損，這是腦片早的病理生理學(xué)改變。如果僅存在突觸前纖維群峰(Fiber Volley, FV)，或FV峰大于突觸后反應(yīng)，這提示腦片活性極差，有活性的突觸已所剩無幾，為激發(fā)突觸反應(yīng)需要更多的突觸前纖維參與，需中止實(shí)驗(yàn)。在活性較好的腦片中，F(xiàn)V峰幾乎探測(cè)不到，或遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于突觸后反應(yīng)。

       有時(shí)會(huì)莫名其妙地出現(xiàn)一些問題，突觸標(biāo)本中突觸后神經(jīng)元看上去狀態(tài)良好，但做了很多天甚至幾周都沒有得到有用的數(shù)據(jù)。在這種情況下，須要耐心地思考失敗的原因，并設(shè)法解決。首先，應(yīng)該檢查溶液，用其它實(shí)驗(yàn)室制備的標(biāo)本或更換實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。對(duì)于腦片的制備而言，切片機(jī)出現(xiàn)的機(jī)械故障會(huì)損壞腦片的質(zhì)量。總之，在實(shí)驗(yàn)的全過程中能盡量注意每一個(gè)細(xì)節(jié)問題，出現(xiàn)問題后反復(fù)嘗試，實(shí)驗(yàn)就會(huì)容易起來。

二、海馬腦片膜片鉗記錄

1、將刺激電極放置在含突觸前纖維腦片區(qū)域附近

       在突觸傳遞的研究中，應(yīng)該同時(shí)記錄突觸前和突觸后神經(jīng)元的電信號(hào)，雖然，并不是所有突觸前神經(jīng)元胞體的動(dòng)作電位均可傳導(dǎo)至突觸 (Vincent, 1996)。由于在突觸前和突觸后兩個(gè)神經(jīng)元上同時(shí)做膜片鉗記錄較困難，因此，需要用其它的方法來誘發(fā)突觸前動(dòng)作電位的發(fā)放。用刺激電極可在單個(gè)或多個(gè)突觸前細(xì)胞或軸突誘發(fā)動(dòng)作電位。另外，還可以用局部施加神經(jīng)遞質(zhì)的方法來誘導(dǎo)動(dòng)作電位，如用短促的壓力、離子電泳或籠鎖谷氨酸光解等方法將谷氨酸加到突觸前胞體或軸突上，可以誘導(dǎo)出多個(gè)動(dòng)作電位。

       用電極刺激 在神經(jīng)元培養(yǎng)皿中，可以用連接了電源(通常是膜片鉗放大器)的微電極直接刺激突觸前神經(jīng)元。在這種情況下，通常需要用負(fù)壓吸引使突觸前的細(xì)胞貼緊刺激電極，防止刺激電流的逸出。通過膜片鉗放大器給脈沖刺激的優(yōu)點(diǎn)是，它可以記錄到突觸前細(xì)胞被激活的胞外電信號(hào)(Role, 1987)。從培養(yǎng)的神經(jīng)元和腦片上找到有突觸聯(lián)系的一對(duì)神經(jīng)元是很困難的，但在神經(jīng)元培養(yǎng)中有單個(gè)神經(jīng)元的Autapic突觸就會(huì)方便許多。

       可以用腦片膜片鉗電極或尖端較細(xì)的一對(duì)鎢電極給突觸前軸突纖維施加電壓脈沖。用電極刺激可將Ag/AgCl電極置于孵育槽中與其構(gòu)成一電流回路。刺激電流一定要與膜片鉗放大器記錄電路隔離開，以防止刺激電流漏入記錄電極中，而使刺激尾跡變得很大。為此，施加刺激需要一個(gè)未接地的隔離器。隔離器可以用外界脈沖刺激或計(jì)算機(jī)來控制。另外，還需要將刺激尾跡縮小到最小，以排除其對(duì)突觸信號(hào)起始段的干擾。為達(dá)到該目的，需將刺激電路的回路電極置于合適的位置或用膜片鉗放大器提高串聯(lián)電阻補(bǔ)償?shù)男省?/span>

       刺激電極的位置通常將刺激微電極或刺激電極置于突觸前軸突通過的部位。但有時(shí)突觸前軸突在制備腦片時(shí)即被去除。如果腦片制備時(shí)局部神經(jīng)環(huán)路被破壞，實(shí)驗(yàn)中就很難成功地記錄到突觸后電流。實(shí)際上，切腦片的角度是保存局部神經(jīng)環(huán)路最重要的因素之一，合適的角度既可使突觸后神經(jīng)元保存完好，也可保留部分較長(zhǎng)的突觸前纖維用于電刺激。用胞外電極刺激激活的神經(jīng)纖維較多，而且，每次刺激激活的纖維數(shù)目也會(huì)不同。如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍⒉煌膫鲗?dǎo)通路分開，那么，必須要證明兩個(gè)刺激電極激活的纖維各不相同。