膜片鉗操作實驗

實驗原理

    膜片鉗技術(shù)是一種通過玻璃微電極與細(xì)胞膜表面形成千兆歐姆以上高阻封接，從而將電極尖端所接觸的一小片細(xì)胞膜在電學(xué)上與其周圍區(qū)域隔離的技術(shù)。

    該方法能夠在電壓固定的條件下，直接測量該膜片上離子通道產(chǎn)生的pA級離子電流。其測量回路的核心是場效應(yīng)管運(yùn)算放大器構(gòu)成的I-V轉(zhuǎn)換器。該放大器正負(fù)輸入端子保持等電位，通過在正輸入端施加指令電壓，可使負(fù)輸入端與封接膜片均被鉗制在同一電位。當(dāng)電極與細(xì)胞膜之間形成超過10GΩ的封接時，漏電流極小，流經(jīng)膜片的電流可幾乎全部作為膜片電極電流（Ip）被記錄和測量。

實驗步驟

運(yùn)用膜片鉗進(jìn)行膜離子通道特性的研究，是一項艱辛、細(xì)致、繁雜的工作，要求較高的技術(shù)水平和實驗條件作保證，現(xiàn)在大致介紹一下膜片鉗實驗的過程，粗略地包括以下幾個方面。

1. 標(biāo)本制備　根據(jù)研究目的的不同，可采用不同的細(xì)胞組織。對所采用的細(xì)胞，必須滿足實驗要求，一般多采用酶解分離法，也可采用細(xì)胞培養(yǎng)法。

2. 電極制備　合格的膜片微電極是成功封接細(xì)胞膜的基本條件。要成功的封接細(xì)胞膜需要兩方面的因素保證，一是設(shè)法造成干凈的細(xì)胞膜表面，二是制成合格的電極。首先要選擇適當(dāng)?shù)牟Ａ?xì)管，其材料可使用軟質(zhì)玻璃（蘇打玻璃、電石玻璃）或硬質(zhì)玻璃（硼硅玻璃、鋁硅玻璃、石英玻璃）。膜片微電極是將玻璃毛細(xì)管用電極拉制儀拉制而成的，制作分三步進(jìn)行：

第一步是分兩次拉制，第一次拉長7～10mm，直徑小于200um，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行第二次拉制，最終使尖端的直徑為1～2um，兩步拉制的目的主要是使電極前端的錐度變大，狹窄部長度縮短，因此可降低電極的串聯(lián)電阻，也可減少全細(xì)胞記錄時的電極液透析時間。由于膜片微電極最忌沾染灰塵和臟物，更忌觸碰尖端附近部位，所以一般要求在使用前制作。

第二步是在電極前端涂以硅酮樹脂（sylgard），其目的是為了降低電極與灌流液之間的電容，并形成一個親水界面。經(jīng)此處理后，上述電容可由6～8pF減少到1pF以下。硅酮樹脂對形成Giga的seals無影響，但可減少本底噪音，對單通道記錄很重要。在進(jìn)行全細(xì)胞記錄時，不用硅酮樹脂也可以得到滿意的效果，通常微電極在涂抹硅酮樹脂后再進(jìn)行拋光，但最好是在涂抹后一小時內(nèi)拋光，否則很難改變電極尖端的形狀。

第三步是拋光，將電極固定于顯微鏡工作臺上，在鏡下將尖端靠近加熱絲，當(dāng)通電加熱時，可見電極尖端微微回縮，此時電極變得光滑，且尖端的雜質(zhì)燒去，得到較干凈的表面。從而有利于和細(xì)胞膜緊密封接，并在封接后更易保持穩(wěn)定。

3.膜片鉗實驗系統(tǒng)　根據(jù)不同的電生理實驗要求，可以組建不同的實驗系統(tǒng)，但有若干共同的基本部件，包括機(jī)械部分（防震工作臺、屏蔽罩、儀器設(shè)備架）、光學(xué)部分（顯微鏡、視頻監(jiān)視器、單色光系統(tǒng)）、電子部件（膜片鉗放大器、刺激器、數(shù)據(jù)采集的設(shè)備、計算機(jī)系統(tǒng)）和微操縱器。

4. 進(jìn)行實驗，記錄和分析數(shù)據(jù)　準(zhǔn)備工作就緒后即可進(jìn)行實驗操作，數(shù)據(jù)記錄和分析。這里主要介紹高阻封接的形成。