【技術(shù)速遞】什么是膜片鉗技術(shù)？

1.膜片鉗技術(shù)的開創(chuàng)      Initiate

      膜片鉗實驗（Patch-clamp recording）是現(xiàn)代電生理學(xué)中一項革命性的技術(shù)，由Erwin Neher和Bert Sakmann于20世紀70年代末開創(chuàng)。     Erwin Neher和Bert Sakmann經(jīng)過13年的辛苦探索，終于在電壓鉗技術(shù)的基礎(chǔ)上，首次在青蛙肌細胞上用雙電極鉗制膜電位的同時，記錄到ACh激活的單通道離子電流，從而發(fā)展出膜片鉗技術(shù)，證明了離子通道的存在。Erwin Neher和Bert Sakmann榮獲1991年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。   

  圖1 Erwin Neher 德國，1944年-     

  圖2   Bert Sakmann 德國，1942年-

2.膜片鉗技術(shù)的原理      Principle

     圖1   膜片鉗記錄的一般原理

      膜片鉗技術(shù)的核心目標是在單個細胞乃至亞細胞水平上，在以前所未有的精度上，記錄離子通道的電流活動。

     其基本原理是利用一個尖端直徑約為1-2微米的玻璃微電極（pipette），通過施加負壓與細胞膜形成一種電阻高達10^9歐姆以上的高阻封接（gigaohm seal）。這種封接在電學(xué)上將電極尖端下的一小塊細胞膜（稱為“膜片”）與細胞其余部分及外部溶液完全隔離，從而極大地降低了背景漏電流和熱噪聲，使得記錄單個離子通道開閉所產(chǎn)生的皮安級微弱電流成為可能。

   圖2   膜片鉗記錄儀器使用一般原理   

3.四種記錄方法      Recording method

         膜片鉗技術(shù)的強大之處在于其多種靈活的記錄構(gòu)型，每種構(gòu)型都為解答特定的生物學(xué)問題而設(shè)計。  

   圖3 膜片鉗技術(shù)的四種記錄方法  

        最基礎(chǔ)的模式是細胞貼附式（cell-attached patch），在此模式下，電極與細胞膜形成吉歐姆封接，但細胞膜保持完整。這使得研究者能夠觀察膜片內(nèi)一個或少數(shù)幾個離子通道在其天然細胞質(zhì)環(huán)境中的活動，而不會干擾細胞內(nèi)部的信號分子。

      當需要研究整個細胞的電活動時，則采用全細胞式（whole-cell recording）。在細胞貼附模式的基礎(chǔ)上，通過施加更強的負壓或短暫的電壓脈沖來破壞電極尖端下的膜片，從而建立電極內(nèi)液與細胞質(zhì)之間的直接電學(xué)和擴散通路。全細胞模式可以記錄流經(jīng)整個細胞膜的所有離子通道的總和電流，是研究動作電位、突觸傳遞等細胞整體電生理特性的主要手段。

     然而，全細胞模式的一個顯著缺點是會導(dǎo)致細胞質(zhì)透析，即細胞內(nèi)的關(guān)鍵第二信使（如ATP、GTP、Ca2?）會被電極內(nèi)液稀釋或沖走，從而導(dǎo)致依賴這些分子的信號通路功能衰減。為克服此問題，研究人員創(chuàng)新了穿孔膜片鉗（perforated-patch）技術(shù)。

    此外，還有兩種游離膜片模式：內(nèi)面向外式（inside-out）和外面向外式（outside-out）。前者通過將電極從細胞上提拉，使膜片的細胞質(zhì)側(cè)暴露于浴液中，便于精確控制和灌流細胞內(nèi)調(diào)控因子；后者則使膜片的細胞外側(cè)暴露于浴液，常用于研究配體門控通道或進行單通道動力學(xué)分析。

4.兩種操作模式      Operation mode

      在操作模式上，膜片鉗系統(tǒng)主要工作于電壓鉗（voltage-clamp）和電流鉗（current-clamp）兩種狀態(tài)。

     電壓鉗模式通過負反饋放大器將細胞膜電位精確地鉗制在研究者設(shè)定的指令電位上，并實時測量為維持該電位所需注入的電流。由于這個注入電流與流經(jīng)細胞膜離子通道的凈電流大小相等、方向相反，因此可以直接反映離子通道的活動。這是研究電壓門控或配體門控離子通道電導(dǎo)、選擇性、激活/失活動力學(xué)等生物物理特性的黃金標準。

     相比之下，電流鉗模式則是向細胞注入一個已知的電流，并記錄由此引發(fā)的膜電位的自然變化。這種模式主要用于觀察神經(jīng)元的動作電位發(fā)放模式、靜息膜電位以及突觸后電位等生理事件。

5.膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用      Application

     圖4 微電極貼附到培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元細胞膜的相差圖像。

圖片取自徠卡官網(wǎng) 由德國波鴻魯爾大學(xué)的Ainhara Aguado博士提供。

      自問世以來，膜片鉗技術(shù)已成為生命科學(xué)研究不可或缺的基石工具。它不僅徹底改變了我們對離子通道這一“分子機器”的理解，還在多個領(lǐng)域發(fā)揮著核心作用。

     在神經(jīng)科學(xué)中，它是解析突觸傳遞機制、繪制神經(jīng)環(huán)路連接、研究學(xué)習(xí)記憶的細胞基礎(chǔ)的關(guān)鍵手段。

    圖5 神經(jīng)軸突和突觸示意圖     在心臟電生理學(xué)和藥物安全藥理學(xué)中，膜片鉗被廣泛用于評估新藥候選物對心臟離子通道（如hERG鉀通道）的潛在致心律失常風險，是臨床前心臟安全性評價的“金標準”。

     在疾病機制研究方面，它被用于診斷和表征由離子通道基因突變引起的“通道病”，如囊性纖維化、長QT綜合征和某些類型的癲癇。

    圖6 人工跨膜離子傳輸通道示意圖

    隨著技術(shù)的發(fā)展，膜片鉗也正朝著自動化和高通量的方向演進。例如，基于微流控芯片的平面膜片鉗（planar patch-clamp）平臺，通過在芯片上集成微孔和電極，能夠?qū)崿F(xiàn)對多個細胞的并行記錄，顯著提高了藥物篩選的效率。

    6.相關(guān)實驗儀器      Complementarity

       顯微操作系統(tǒng) 分辨率的顯微鏡（通常配備微分干涉差DIC或霍夫曼調(diào)制對比HMC光學(xué)系統(tǒng)）用于可視化。微操縱器則用于精確控制電極在三維空間中的移動，其步進精度需達到納米級別，以確保電極能輕柔、準確地接觸目標細胞膜并形成高阻封接。     

      玻璃微電極及其制備設(shè)備 微電極通常由硼硅酸鹽玻璃毛細管經(jīng)微電極拉制儀（Micropipette Puller）拉制而成，再通過微鍛儀（Microforge）進行拋光，以獲得光滑、尺寸均一的尖端。電極的物理特性（如尖端直徑、錐度、電阻）對封接成功率和記錄質(zhì)量有決定性影響。

     膜片鉗放大器 主要功能是在電壓鉗模式下將微弱的皮安級離子通道電流轉(zhuǎn)換為可測量的電壓信號，同時在電流鉗模式下精確注入設(shè)定的電流并記錄膜電位變化。     

     振動隔離與電磁屏蔽系統(tǒng) 實驗臺必須置于氣浮式防震臺上，并放置在法拉第籠內(nèi)，以有效隔絕地面振動和環(huán)境電磁噪聲。

       水平拉制儀   HL-1000   水平拉制儀具有編制不同拉動程序的能力,可以方便地在一個儀器上拉制各種類型的玻璃微電極。  

參考文獻： 【1】Nagarah, J. M., Paek, E., Luo, Y., Wang, P., Hwang, G. S., & Heath, J. R. (2010). Batch Fabrication of High‐Performance Planar Patch‐Clamp Devices in Quartz. Advanced Materials, 22(41), 4622–4627. 【2】Xu, B., Ye, W., Zhang, Y., Shi, J., Chan, C., Yao, X., & Yang, M. (2014). A hydrophilic polymer based microfluidic system with planar patch clamp electrode array for electrophysiological measurement from cells. Biosensors and Bioelectronics, 53, 187–192.